ВЫДЕЛЕНИЕ И РАДИОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АТР: ТИАМИНДИФОСФАТФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА СВИНЬИ
Аннотация
Введение. Назначение и биологические пути регуляции уровня трифосфорного эфира тиамина в клетке остаются невыясненными. Связано это с отсутствием надёжной методологической основы оценки активности фермента биосинтеза метаболита – АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы (КФ 2.7.4.15).
Цель. Разработать адекватный способ разделения ингредиентов трансферазной реакции, выделить частично очищенный препарат фермента.
Материал и методы. В качестве субстрата использовался экзогенный, полученный нами, 14С – тиаминдифосфат. Образовавшийся продукт – трифосфорный эфир тиамина – отделяли ионообменной хроматографией.
Результаты. Из митохондриальной фракции головного мозга свиньи выделен частично очищенный препарат трансферазы с выходом 14,2%. Установлено, что максимальная ферментативная активность проявляется при pH 7,0-8,5, концентрациях тиаминдифосфата 2,5 – 3,0∙10-5 М.
Выводы. Предложенный изотопный метод обладает достаточной чувствительностью и позволяет фиксировать АТР: тиаминдифосфатфосфо-трансферазную активность в субклеточных фракциях мозга.
Литература
Makarchikov AF. Tiamintrifosfat: novyj vzgljad na nekofermentnuju funkciju vitamina B1 [Thiaminetriphosphate: a new view on uncoenzyme function of vitamin B1]. Мinsk: Belorusskaja nauka; 2008. 443 p.
Parhomenko YuM, Donchenko GV, Protasova ZS. Nejroaktivnost tiamina: fakty i gipotezy [Neuroactivity of Tiaminum: facts and hypothesis]. Ukrainskij biohimicheskij zhurnal [The Ukrainian Biochemical Journal]. 1996;68(2):3-14.
Bettendorff L, Wins P. Thiamine derivatives in excitable tissues: metabolism, deficiency and neurodegenerative diseases. Recent Res. Devel. Neurochem. 1999;2(1):37- 62.
Itokawa Y. Thiamine and nervous system function: an historical sketch. Metab. Brain. Dis. 1996;11(1):1-7.
Itokawa Y, Cooper JR. The enzymatic synthesis of triphosphothiamin. Biochim. Biophys. Acta. 1968;158(1):180-182.
Murphy JV, Craig LJ, Glew RH. Leigh’s disease: biochemical characteristics of the inhibitor. Arch. Neurol. 1974;31(4):220-227. doi: 10.1001/archneur. 1974.00490400034002.
Eckert T, Möbus W. Über eine ATP: Thiamindiphosphat- Phosphotransferasa-Aktivität im Nervengewebe Ein Beitrag zum Mechanismus der nervösen Reizleitung. Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1964;338(1-2):286-288. doi: 10.1515/bchm2.1964.338.1-2.286.
Ruenwongsa P, Cooper JR. The role of bound thiamine pyrophosphate in the synthesis of thiamine triphosphate in rat liver. Biochym. Biophys. Acta. 1977;482(1):64-74.
Voskoboyev AI, Chernikevich IP, Luchko VS. Studies on thiamine diphosphate kinase (EC 2.7.4.15) from brewer’s yeast: purification and some properties. Biomed. Biochim. Acta. 1987;46(1):3-13.
Hashitani Y, Cooper JR. The partial purification of thiamine triphosphatase from rat brain. J. Biol. Chem. 1972;247(7):2117-2119.
Makarchikov AF, Chernikevich IP. Purification and characterization of thiamine triphosphatase from bovine brain. Biochim. Biophys. Acta. 1992;1117(3):1326-1332. doi: 10.1016/0304-4165(92)90032-P.
Egi Y, Koyama S, Shikata H, Yamada K, Kawasaki T. Content of thiamin phosphate esters in mammalian tissues – an extremely high concentration of thiamin triphosphate in pig skeletal muscle. Biochem. Int. 1986;12(3):385-390.
Nishimune T, Hayashi R. Hydrolysis and synthesis of thiamine triphosphate in bacteria. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1987;33(2):113-127.
