ОСОБЕННОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ТИАМИНКИНАЗЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА СВИНЬИ, КОВАЛЕНТНО МЕЧЕНОЙ ПИРИДОКСАЛЬ-5'-ФОСФАТОМ
Аннотация
С использованием флуоресцентной метки (пиридоксаль-5'-фосфата) исследованы свойства и параметры тиаминкиназы (КФ 2.7.6.2) головного мозга свиньи при её взаимодействии с субстратами (тиамин, АТР), кофактором (ионами магния) и эффектором (пируватом). Показано, что молекула фермента содержит два быстрореагирующих центра связывания метки по ε- или N-концевым α-аминогруппам лизиновых остатков с КS 0,9 ∙103 М-1. Модификация аминогрупп сопровождается выраженным увеличением скорости ферментативной реакции, причём характер изменения скорости свидетельствует о неоднозначности обоих участков. Активация тиаминкиназы меткой объясняется наличием в ней карбонильной группы и схожа по механизму с активацией пируватом. Пируват и субстрат фермента – тиамин, независимо от последовательности своего внесения, эффективно тушат флуоресценцию обоих типов хромофоров метки, указывая на функциональную взаимосвязь их центров сорбции, реализуемую посредством конформационных изменений белковой молекулы. Центры сорбции АТР и ионов металла пространственно удалены от метки.
Литература
Башарин, С. К. Разложение свёртки кривых затухания флуоресценции / С. К. Башарин, Г. А. Гачко, Л. Н. Кивач // Журн. прикладной спектроскопии. – 1990. – Т. 52, № 1. – С.48-52.
Бурштейн, Э. А. Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования) // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. – М. : ВИНИТИ, 1976. – Т. 6. – 171с.
Гачко, Г. А. Автоматизированный импульсный спектрофлуориметр / Г. А. Гачко, В. К. Зыбельт, Л. Н. Кивач // Журн. прикладной спектроскопии. – Т. 47, № 2. – С.335-339.
Ермолаев, В. Л. Безизлучательный перенос энергии электронного возбуждения / В. Л. Ермолаев, Е. И. Бодунов, Е. Б. Свешникова. – Л. : Наука, 1977. – 328с.
Керрижд, Д. Биохимическая логика / Д. Керридж, К. Типтон. – М. : Мир, 1974. – 328с.
Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович. – М. : Мир, 1986. – 496 с.
Маскевич, А. А. Флуоресцентные исследования внутримолекулярной подвижности тиаминкиназы из пивных дрожжей / А. А. Маскевич, И. П.Черникевич, С. А. Маскевич // Журн. физ. химии. – 1990. Т. 64, № 8. – С. 2162-2168.
Островский, Ю. М. Тиамин / Ю. М. Островский. – Мн. : Беларусь, 1971. – 144с.
Черникевич, И. П. Спектрально-кинетические исследования структуры и динамики тиаминкиназы головного мозга свиньи / И. П. Черникевич // Журн. ГрГМУ. – 2015. – № 2. – C. 63-60.
Черникевич, И. П. Сравнительный кинетический анализ тиаминкиназ из пивных дрожжей и головного мозга свиньи / И. П. Черникевич // Журн. ГрГМУ. – 2011. – № 3. – С.25-28.
Черникевич, И. П. Ферментные системы биотрансформации активных форм витамина В1 (структура, свойства, регуляция): автореф. дис. … докт. хим. наук: 03.00.04 / И. П. Черникевич; Минск. ин-т биоорганической химии. – Минск, 1996. – 32с.
Черницкий, Е. А. Спектральный люминесцентный анализ в медицине / Е. А. Черницкий, Е. И. Слабожанина. – Мн. : Наука и техника, 1989. – 141с.
Chang,S.I. Amino acid sequences of pyridoxal-5'phosphate binding sites and fluorescence resonance energy transfer in chicken liver fatty acid synthese / S. I. Chang, G. G. Hammes // Biochemistry. – 1989. – V. 28, № 9. – P. 3787-3788.
Kaziro,Y. Quantitative determination of thiamine pyrophosphate using apocarbaxylase and alcohol dehydrogenase / Y. Kaziro // J. Biochem. – 1957. – V. 44, № 7. – P. 827-838.
Lowry, O. N. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. N. Lowry, N. J. Rosenbrough, A. L. Farr // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193. – P. 265-275.
O'Connor, D. V. Time-соrrelated Single Photon Counting // D. V. O'Connor, D. Phillips // Acad. Press. – 1984. – P. 283.
Scatchard,C. The attractions of proteins for small molecules and ions / C. Scatchard // Ann. Molec. Inter.– 1949. – V. 51, № 4. – P. 573-582.
Ullrich, J. Assay of thiamine pyrophosphate / J. Ullrich // Methods Enzymol. – 1970. – V. 18 A. – P. 109-115.
Viljoen, C. C. Histidine and lysine residues and the activity of phospholipase A2 from the venom of Bitis Gabonica / C. C. Viljoen, L. Visser, P. P. Boten // Biochim. Biophys. Acta. – 1977. – V. 483, № 1. – P.107-120.
Voss, K. Application of a reference convolution method to tryptophane fluorescence in proteins / K. Voss, A, Hock, A. J. W. G. Visser // Eur. J. Biochem. – 1987. – V. 165, № 1. – P. 55-63.
