МЕМБРАННО-АССОЦИИРОВАННАЯ ТИАМИНКИНАЗА ИЗ ГОЛОВНОГО МОЗГА СВИНЬИ: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ И ОТДЕЛАХ, АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ
Аннотация
Введение. Тиаминкиназа – фермент медицинского назначения, генетически детерминированные «поломки» при синтезе которого приводят к ряду нейродегенеративных заболеваний. Знание распределения фермента в компартментах мозга, регуляторных возможностей глобулы в образовании коферментной формы витамина В1 – тиаминдифосфата – позволит вести направленную коррекцию патологических состояний. Цель. Выяснить локализацию фермента в мозге свиньи, роль гидрофобных и гидрофильных взаимодействий в ассоциации на мембранах, природу аминокислотных остатков, определяющих структуру белка. Материал и методы. Для получения мембран свежий очищенный от оболочек и сосудов мозг измельчали, заливали четырьмя объемами охлажденного трис-HCl буфера (50 мМ, рН 7,4) с 0,2 мМ ЭДТА и гомогенизировали (2000 об•мин–1) 5 циклами. Гомогенат центрифугировали (60 минут при 30000 g), супернатант отбрасывали, оставшиеся в осадке мембраны подвергали солюбилизации исходным буфером, содержащим в своем составе 0,05-1% детергенты. Активность фермента оценивали по скорости образования тиаминдифосфата. Гидролиз белка осуществляли в вакуумированных ампулах с 6 М HCl при 110°С в течение 18, 22, 48 и 72 часов. Изоэлектрическую точку (р1) рассчитывали по аминокислотному составу и с помощью метода изоэлектрофокусирования. Изоионную точку находили посредством диализа тиаминкиназы с последующим измерением рН в диализате. Результаты. Установлено, что гидрофобные детергенты обладают более выраженным солюбизирующим эффектом по сравнению с гидрофильными. При высоких значениях критической концентрации мицелообразования (1%) и те и другие изменяют конформационное состояние макромолекулы, влияя на ее сродство к субстратам и эффекторам. Тиаминкиназа достаточно равномерно рассредоточена во всех отделах мозга, однако субклеточная локализация разная. Наибольшая ферментативная активность прослеживается в митохондриальных фракциях. Фермент характеризуется повышенной концентрацией аминокислот, способствующих α-спирализации белковой глобулы при одновременно низком содержании остатков, связывающих полипептидные цепи и высоком – осуществляющих их резкий поворот на 130°, несовместимый с ходом α-спирали. Выводы. Тиаминкиназа головного мозга – мембранно-ассоциированный белок. Во взаимодействии с липидным бислоем мембран задействованы в основном гидрофобные силы. В зависимости от концентрации детергента процесс солюбилизации сопровождается изменением конформации глобулы. Основное количество тиаминкиназы сосредоточено в митохондриальных мембранах.
Литература
Debs R, Depienne C, Rastetter A, Bellanger A, Degos B, Galanaud D, Keren B, Lyon-Caen O, Brice A, Sedel F. Biotin-responsive basal ganglia disease in ethnic Europeans with novel SLC19A3 mutations. Arch Neurol. 2010;67(1):126-130. https://doi.org/10.1001/archneurol.2009.293.
Ruhoy IS, Saneto RP. The genetics of Leigh syndrome and its implications for clinical practice and risk management. Appl Clin Genet. 2014;7:221-234. https://doi.org/10.2147/TACG.S46176.
Kevelam SH, Bugiani M, Salomons GS, Feigenbaum A, Blaser S, Prasad C, Häberle J, Baric I, Bakker IM, Postma NL, Kanhai WA, Wolf NI, Abbink TE, Waisfisz Q, Heutink P, van der Knaap MS. Exome sequencing reveals mutated SLC19A3 in patients with an early-infantile, lethal encephalopathy. Brain. 2013;136(5):1534-1543. https://doi.org/10.1093/brain/awt054.
Rosenberg MJ, Agarwala R, Bouffard G, Davis J, Fiermonte G, Hilliard MS, Koch T, Kalikin LM, Makalowska I, Morton DH, Petty EM, Weber JL, Palmieri F, Kelley RI, Schäffer AA, Biesecker LG. Mutant deoxynucleotide carrier is associated with congenital microcephaly. Nat Genet. 2002;32(1):175-179. https://doi.org/10.1038/ng948.
Gibson GE, Hirsch JA, Cirio RT, Jordan BD, Fonzetti P, Elder J. Abnormal thiamine-dependent processes in Alzheimer’s Disease. Lessons from diabetes. Mol Cell Neurosci. 2013;55:17-25. https://doi.org/10.1016/j.mcn.2012.09.001.
Luong KV, Nguyen LT. The beneficial role of thiamine in Parkinson disease. CNS Neurosci Ther. 2013;19(7):461-468. https://doi.org/10.1111/cns.12078.
Scalzo SJ, Bowden SC, Ambrose ML, Whelan G, Cook MJ. Wernicke-Korsakoff syndrome not related to alcohol use: a systematic review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2015;86(12):1362-8. https://doi.org/10.1136/jnnp-2014-309598.
Chernikevich IP, Hilmanovich EN, Kravec EV. Vydelenie i radiometricheskij metod opredelenija aktivnosti ATF: tiamindifosfatfosfotransferazy iz mitohondrij golovnogo mozga svini [Selection and radiometric method of determining the activity of ATP: thiaminediphosphatep hosphotransferase from mitochondria of the pig’s brain tissue]. Zhurnal Grodnenskogo gosudarstvennogo medicinskogo universiteta [Journal of the Grodno State Medical University]. 2017;15(4):442-446. https://doi.org/10.25298/2221-8785-2017-15-4-442-446 (Russian).
Chernikevich IP. Sravnitelnaja kineticheskaja harakteristika tiaminkinaz iz pivnyh drozhzhej i golovnogo mozga svini [Comparative kinetic analysis of thiaminkinases from brewer’s yeast and pig’s brain]. Zhurnal Grodnenskogo gosudarstvennogo medicinskogo universiteta [Journal of the Grodno State Medical University]. 2011;(3):25-28 (Russian).
Makarchikov AF. Tiamintrifosfat: novyj vzgljad na nekofermentnuju funkciju vitamina B1 [Thiamine triphosphate: a new look at the non-coenzymatic function of vitamin B1]. Minsk: Belorusskaja nauka; 2008. 430 p. (Russian).
